Dr hab. n. med. Mariusz PUSZCZEWICZ

Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych

ANCA to szczególnie istotny wykładnik serologiczny zapaleń naczyń.

Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych po raz pierwszy opisali w 1982 r.  Davies i wsp. u 8 chorych na  kłębuszkowe zapalenie nerek. W 1985 r.  der Woude i wsp. wykazali  obecność  przeciwciał swoiście reagujących z ziarnistościami cytoplazmy granulocytów obojętnochłonnych (PMNs)  w surowicy chorych na ziarniniaka Wegenera i nazwali je anti-neutrophil cytoplasmic antibodies – ANCA . W  dalszych badaniach okazało się, że ANCA pojawiają się także w innych chorobach związanych z zapaleniem naczyń, szczególnie w zespole Churga i Straussa oraz mikroskopowej postaci guzkowego zapalenia tętnic. Obecnie ANCA  uważane są za  szczególnie istotny wykładnik serologiczny zapaleń  naczyń, głównie ziarniniaka Wegenera, mikroskopowej postaci guzkowego zapalenia tętnic (MPA) i gwałtownie postępującego idiopatycznego kłębuszkowego zapalenia nerek.

Metody wykrywania ANCA

Immunofluorescencja pośrednia

Do  rutynowej oceny obecności ANCA w surowicy krwi oraz w płynach ustrojowych  wykorzystuje się metodę immunofluorescencji pośredniej. W metodzie tej jako źródło antygenu stosuje się granulocyty obojętnochłonne izolowane z surowicy krwi osób zdrowych. Izolacji dokonuje się w taki sposób, aby nie doszło do aktywacji  komórek, gdyż prowadzi to do uwolnienia enzymów z ziarnistości cytoplazmatycznych – PMNs  nie mogą wówczas służyć za źródło antygenów. Uzyskane komórki utrwala się w 96% alkoholu etylowym w temperaturze 4^oC.

Przy użyciu metody immunofluorescencji pośredniej wyróżnia się trzy typy ANCA: C-ANCA (cytoplasmic – typ cytoplazmatyczny, ryc. 1), P-ANCA (perinuclear – typ   około jądrowy, ryc. 2) oraz A-ANCA (atypical – atypowe).

Ryc. 1. C-ANCA

Typ cytoplazmatyczny charakteryzuje się gruboziarnistym „świeceniem” całej cytoplazmy komórki, ze szczególnym nasileniem w obszarze między płatami jądra. Podobny obraz daje typ A-ANCA, jednak  świecenie zwykle jest wówczas drobnoziarniste lub linijne. Natomiast P-ANCA wywołują intensywne „świecenie” wokół jądra komórkowego. Typy  ANCA określane metodą IIF powinny być bardzo  krytycznie interpretowane, ze względu na  możliwość fałszywie dodatnich wyników, szczególnie u chorych po wielokrotnych  przetoczeniach krwi oraz u kobiet po licznych ciążach. Dochodzi wówczas łatwo do  alloimmunizacji i powstania przeciwciał przeciw składowym cytoplazmy PMNs.

ELISA

Kolejną metodą wykorzystywaną do oceny ANCA jest ELISA. Służy ona głównie do określenia swoistości antygenowej tych autoprzeciwciał.

Antygeny

Do chwili obecnej nie udało się scharakteryzować dokładnie wszystkich antygenów, z którymi reagują ANCA. Większość z nich znajduje się w obrębie ziarnistości azurofilnych granulocytów obojętnochłonnych i lizosomów monocytów.

C-ANCA reagują głównie z proteinazą 3 (29KD proteinazą serynową), znajdującą się w ziarnistościach azurofilnych granulocytów (PR-3 ANCA). Znacznie rzadziej antygenem   dla nich bywa białko BPI (bactericidal permeability increasing protein), a także enolaza i lizozym. W 1% przypadków również mieloperoksydaza powoduje cytoplazmatyczny  typ „świecenia” ANCA .

Głównym antygenem dla P-ANCA jest natywna mieloperoksydaza zawarta w  ziarnistościach azurofilnych. Wykazano, że P-ANCA mogą reagować swoiście z katepsyną G,  laktoferryną, elastazą i katalazą.

Okazuje się, że nie wszystkie przeciwciała reagujące z ziarnistościami cytoplazmy PMNs  powodują odpowiedni typ świecenia w metodzie immunofluorescencji pośredniej. Około 50% ANCA  reagujących swoiście z białkiem BPI nie powoduje świecenia w metodzie  IIF.

Ryc. 2. P-ANCA

Klasy immunoglobulin ANCA

Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych  należą najczęściej do immunoglobulin klasy G.  Stwierdzono, że są to głównie podklasy IgG1 i IgG4. Obecność ANCA w podklasie IgG3 ma prognozować dużą aktywność kliniczną zapalenia naczyń. ANCA mogą występować także w innych klasach immunoglobulin. Obecność ANCA w klasie IgA  stwierdzono u chorych z zespołem Schönleina i Henocha, nefropatią IgA, wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego oraz w  przebiegu zapalenia naczyń obejmującego głównie skórę. Natomiast ANCA w klasie IgM wykazano w przypadku krwotocznego  zapalenia naczyń obejmującego nerki i płuca. Nie zaobserwowano korelacji między nasileniem objawów klinicznych a klasą ANCA.

Związek ANCA z  zespołami chorobowymi

Obecność ANCA stwierdzano głównie w przebiegu niektórych chorób reumatycznych, chorób nerek, wątroby, jelita grubego, płuc oraz chorób indukowanych lekami i toksynami.

Występowaniem ANCA w przebiegu układowych chorób tkanki łącznej zajmowało się wielu badaczy. Wykazano je u chorych z ziarniniakiem Wegenera, w zespole Churga i Straussa, chorobie Behçeta, w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów, przewlekłego młodzieńczego zapalenia stawów, zespołu Felty`ego, tocznia rumieniowatego układowego, twardziny  układowej, zespołu Sjögrena, zapalenia wielomięśniowego, w reaktywnym zapaleniu stawów oraz u chorych z zespołem antyfosfolipidowym i mieszaną krioglobulinemią. Ścisły związek pomiędzy C-ANCA /PR-3 ANCA a ziarniniakiem Wegenera wykazano w licznych publikacjach. U 80–95 % chorych na ziarniniaka Wegenera stwierdza się C-ANCA przy użyciu metody immunofluorescencji pośredniej. Czułość tych autoprzeciwciał  uwarunkowana jest aktywnością choroby oraz rozległością zmian. Ostatnie badania wykazały, że czułość dla nieaktywnej postaci choroby wynosi 63%, zaś dla postaci aktywnej – 91%, swoistość określono zaś na 95–99%. W  pozostałych chorobach, szczególnie w mikroskopowej postaci guzkowego zapalenia tętnic i zespole Churga i Straussa, u 70% osób stwierdzono P-ANCA, które swoiście reagowały z mieloperoksydazą. U około 25% chorych na MPA wykazano także ANCA reagujące z PR-3. ANCA stwierdzano również u 40–60% osób z rzadką postacią zapalenia naczyń obejmującego ośrodkowy układ nerwowy. U większości chorych były to  P-ANCA reagujące swoiście z MPO, jednak w nielicznych przypadkach C-ANCA. W przebiegu choroby Behçeta wykazywano również obecność ANCA, jednak w ostatnio przeprowadzonych badaniach na dużej liczbie chorych obserwacje te nie zostały potwierdzone.

Obecność  P- lub A-ANCA stwierdzano w przebiegu tocznia układowego, reumatoidalnego zapalenia stawów i zespołu Sjögrena u 15–30% chorych. U osób z reumatoidalnym zapaleniem stawów ANCA reagowały z licznymi antygenami, do których należą MPO, laktoferryna i lizozym. Jednak główny antygen do chwili obecnej nie został zidentyfikowany. Natomiast w surowicy chorych na toczeń układowy wykazano obecność ANCA, które reagowały swoiście z laktoferryną, MPO i katepsyną G. W przebiegu układowych chorób tkanki łącznej rzadko wykrywa się ANCA reagujące swoiście z proteinazą-3. Obecność ANCA wykazano także w przypadkach choroby Kawasaki oraz w przebiegu zespołu Sweeta i Coghana.

W przypadku idiopatycznego, szybko postępującego kłębuszkowego zapalenia nerek  ANCA obecne są u 45–65% chorych. Reagują one głównie z mieloperoksydazą. W przebiegu pełnoobjawowego zespołu Goodpasture’a u 20–40% chorych wykazano obecność ANCA równocześnie z  przeciwciałami przeciw błonie podstawnej. Reagowały one głównie z mieloperoksydazą, dając okołojądrowy typ świecenia w metodzie  immunofluorescencji pośredniej.

ANCA wykrywa się także w innych chorobach o podłożu autoimmunologicznym. Należą do nich wrzodziejące zapalenie jelita grubego, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby i pierwotne twardniejące zapalenie dróg żółciowych. Ich obecność wykazano w surowicy krwi u 40–80% chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego i w 10–20% przypadków choroby Leśniowskiego-Crohna. W metodzie immunofluorescencji pośredniej w większości  dawały atypowy typ świecenia, w nielicznych przypadkach były to P-ANCA. Reagowały głównie z katepsyną G i BPI. Wykazano także, że mogą być skierowane przeciwko lamininie A i B1. W przypadku chorób wątroby o podłożu autoimmunologicznym ANCA wykazano u 65–80%  osób z pierwotnym twardniejącym zapaleniem dróg żółciowych i 65–95 % osób chorych na autoimmunologiczne zapalenie wątroby. Były to głównie p-ANCA, które reagowały swoiście z laktoferryną.

ANCA wykrywano również w przebiegu zakażenia wirusem HIV,  aktywnej postaci gruźlicy, zapaleniu wsierdzia, zakażeniach grzybiczych, amebiozie i malarii. Większość przypadków to pojedyncze opisy kazuistyczne. Obecność ANCA była prawdopodobnie raczej wynikiem aktywacji granulocytów obojętnochłonnych niż wykładnikiem zapalenia naczyń.

U  osób leczonych metizolem, propylotiouracylem, sulfasalazyną, D-penicylaminą, minocykliną, hydralazyną, a także allopurynolem, u których obserwowano objawy kliniczne zapalenia naczyń, wykazano również  obecność ANCA.,W większości przypadków były to P-ANCA, które reagowały swoiście z MPO oraz elastazą. ANCA skierowane przeciw PR-3  wykazywano także u chorych leczonych tiouracylem.

ANCA, które wykrywano w przebiegu pylicy oraz u chorych na mukowiscydozę, skierowane były przeciw MPO. Ostatnie badania wskazują, że przeciwciała te są obecne u osób z przewlekłą kolonizacją układu oddechowego przez Pseudomonas aeruginosa.

Wykazano je także  u chorych z zatorami cholesterolowymi, po transplantacji nerek  powikłanej zapaleniem naczyń, w przebiegu zapalenia rdzenia kręgowego, zapalenia tęczówki, w chorobie Bürgera oraz u osób, u których w młodym wieku obecne były zaawansowane zmiany miażdżycowe. Natomiast atypowe ANCA wykrywano u chorych leczonych immunoglobulinami podawanymi dożylnie, szczególnie gdy stosowano duże dawki.

Znaczenie kliniczne ANCA

Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych odgrywają ważną rolę w diagnostyce serologicznej zapaleń naczyń. Dotychczas postępowanie diagnostyczne w tych zespołach chorobowych opierało się głównie na ocenie objawów klinicznych i biopsji  narządu, w którym toczył się proces zapalny. Obecnie uważa się, że ANCA – zarówno C-ANCA, jak i P-ANCA, są bardzo istotne w potwierdzaniu rozpoznania układowych postaci zapalenia naczyń, stanowią także marker w rozpoznawaniu ziarniniaka Wegenera. Wykazano, że obecne są one u 65% osób z nieaktywną i 95–99% osób z aktywną postacią tej choroby. Ich miano koreluje z aktywnością procesu zapalnego, a także z odpowiedzią na zastosowane leczenie. Nawrót ziarniniaka Wegenera manifestuje się zwiększeniem miana ANCA, zwłaszcza podklasy IgG3. Średni czas, który upływa między wzrostem miana przeciwciał a pojawieniem się objawów klinicznych, wynosi 7 tygodni. Miano ANCA u osób z ziarniniakiem Wegenera radykalnie obniża się po transplantacji nerek. Chorzy, u których stwierdza się PR3-ANCA, wykazują częste zajęcie górnych dróg oddechowych i okołonaczyniowe nacieki w obrębie zajętego narządu. Natomiast MPO-ANCA pojawiają się najczęściej u osób w podeszłym wieku z zajęciem obwodowego układu nerwowego, płuc i nerek. Śmiertelność chorych na mikroskopową postać guzkowego zapalenia tętnic była wyższa, gdy stwierdzano C-ANCA , niż w przypadkach, w których obecne były P-ANCA. Wykazano także, że obecność C-ANCA wiąże się ze złym rokowaniem co do czynności nerek. Z klinicznego punktu widzenia istotne jest odróżnianie mikroskopowego guzkowego zapalenia tętnic od klasycznej postaci tej choroby. Obserwacje wskazują, że miano P-ANCA wzrasta, gdy dochodzi do wznowy choroby, jednak stwierdza się to u 50% chorych. Natomiast w przypadku MPA ANCA obecne są u około 50–75% chorych, a w zajęciu ośrodkowego układu nerwowego procesem zapalnym o typie vasculitis u 50–70%. Swoistość C-ANCA dla ziarniniaka Wegenera wynosi 95%, zaś p-ANCA dla MPA 80–90%.

„Przegląd Reumatologiczny” 2008, nr 3-4 (21-22), s. 5, 8.