Dr n. med. Dorota MUSIAŁ

Zakład Technik Molekularnych UM  we Wrocławiu

Znaczenie HLA-B27 w diagnostyce zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa

HLA-B27 stanowi czuły marker genetyczny zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa. Jest przydatny w przewidywaniu ryzyka wystąpienia choroby, rozpoznawaniu jej wczesnego stadium, może także zwiastować jej ciężki przebieg.

I. Epidemiologia

Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ZZSK) jest przewlekłą zapalną chorobą reumatyczną szkieletu osiowego, połączeń stawowych i ścięgien, prowadzącą do ich stopniowego usztywnienia. Częstość występowania choroby w populacji polskiej nie została dokładnie określona. Szacunkowe dane epidemiologiczne wskazują, że odsetek chorych na ZZSK waha się od 0,05 do 0,23% [1]. Choroba występuje od dwóch do trzech razy częściej u mężczyzn i ma u nich cięższy przebieg. Etiologia ZZSK nie została dotąd wyjaśniona. Wiadomo, że czynniki genetyczne, takie jak obecność HLA-B27, odgrywają istotną rolę w etiopatogenezie. U krewnych pierwszego stopnia chorobę stwierdza się 10–20-krotnie częściej w porównaniu z populacją ogólną. Innym ważnym czynnikiem wpływającym na proces zapalny są cytokiny, w tym czynnik martwicy nowotworów (Tumour Necrosis Factor – TNF-α).

II. Kryteria diagnostyczne ZZSK

Rozpoznanie ZZSK jest ustalane na podstawie zmodyfikowanych kryteriów nowojorskich z 1984 r. [2] następującej treści:

Kryterium radiologiczne:

• zapalenie stawów krzyżowo-biodrowych, co najmniej II stopnia obustronne lub III–IV stopnia jednostronne.

Kryteria kliniczne:

• trwające dłużej niż 3 miesiące ból krzyża i sztywność w tej okolicy, które zmniejszają się pod wpływem ćwiczeń, a nie po odpoczynku.
• ograniczenie ruchomości odcinka lędźwiowego kręgosłupa, zarówno w płaszczyźnie strzałkowej, jak i czołowej.
• ograniczenie ruchomości klatki piersiowej w odniesieniu do wartości odpowiednich dla płci i wieku.

Diagnoza wymaga spełnienia kryterium radiologicznego potwierdzonego badaniem RTG oraz przynajmniej dwóch z trzech pozostałych kryteriów klinicznych. Kryteria te nie są dość czułe ani wystarczające do rozpoznania wczesnej fazy choroby. W tego typu przypadkach znaczenie rozpoznawcze może mieć wykrycie u chorego HLA-B27. U ok. 90% osób rasy białej z potwierdzonym ZZSK stwierdza się ekspresję HLA-B27 [3, 4].

III. Antygent zgodności tkankowej - HLA

Antygeny głównego kompleksu zgodności tkankowej (major histocompatibility complex – MHC), u człowieka nazywane HLA, są kodowane przez zespół wieloallelicznych genów zgrupowanych na krótszym ramieniu 6. chromosomu. Najbardziej polimorficznym genem tego chromosomu, jak również całego ludzkiego genomu, jest HLA-B [5]. Liczba opisanych alleli HLA-B zwiększa się nieustannie z powodu ich wykrywania za pomocą coraz nowocześniejszych metod analizy DNA. W 2000 r. wyniosła ona 286 alleli, w 2003 – 511 alleli, w 2004 – 559 alleli, w 2006 – 784 alleli, a w 2008 – 1029 alleli [według danych Anthony Nolan Research Institute Database]. 51 z ponad 1000 alleli HLA-B stanowią podtypy HLA-B27. Jak wynika ze studiów literaturowych, stosunkowo często występujące subtypy: HLA-B*2705, HLA-B*2704 i HLA-B*2702 wykazują szczególnie silną asocjację z ZZSK, podczas gdy HLA-B*2706 i HLA-B*2709 nie mają znaczenia klinicznego [6].

IV. Metody wykrywania HLA-B27

Antygeny zgodności tkankowej mogą być oznaczane serologicznie lub genetycznie.

Metody serologiczne

Typowanie serologiczne może opierać się na teście mikrolimfocytotoksycznym (microlymphocytotoxicity test – MLCT), w którym przeciwciała rozpoznają białka antygenów HLA-B27 na powierzchni limfocytów i niszczą (lub nie) komórki z danym antygenem. Śmierć komórek wykazana barwieniem, np. błękitem trypanu potwierdza, że badane komórki posiadały testowany antygen [7, 8, 9]. Fenotypowanie HLA-B27 można również przeprowadzić z wykorzystaniem testu cytometrycznego (flow cytometry – FC), w którym mieszanina przeciwciał skoniugowanych z fluorochromem pozwala na identyfikację i zliczenie populacji komórek wykazujących ekspresję HLA-B27 w próbce pacjenta. Oceny dokonuje się przez porównanie natężenia fluorescencji próbki badanej z natężeniem fluorescencji certyfikowanych próbek HLA-B27⁺ i HLA-B27^- [10, 11]. Badania serologiczne mają duże ograniczenia spowodowane dostępnością surowic diagnostycznych anty-HLA-B27 i przeciwciał monoklonalnych. Liczba rozpoznawanych swoistości antygenowych będzie zawsze mniejsza od liczby alleli, które można zróżnicować za pomocą technik biologii molekularnej. Wynika to z liczby oraz trzeciorzędowej struktury cząsteczek białek HLA-B27, które nie zawsze są dostępne dla przeciwciał diagnostycznych. Test serologiczny, wymagający żywych limfocytów, jest trudny do wykonania zwłaszcza u chorych na nowotwory krwi. Trudności techniczne mogą wynikać ze zbyt małej liczby limfocytów do badań, z zaburzeń ekspresji antygenów na powierzchni limfocytów bądź z wpływu leków powodujących obumarcie limfocytów, niezależnie od działania surowic diagnostycznych czy przeciwciał monoklonalnych [7, 8]. Istnieją również doniesienia potwierdzające, że u pacjentów z infekcją Salmonella lub Yersinia ekspresja HLA-B27 dramatycznie spada i pozostaje na niskim lub zerowym poziomie nawet przez kilka miesięcy. Stwarza to ryzyko uzyskania fałszywie negatywnych wyników [12, 13]. Ponadto przeciwciała monoklonalne rozpoznające antygen HLA-B27 reagują krzyżowo z innymi antygenami locus B, zwłaszcza z często występującym w populacji kaukaskiej HLA-B7 (wyniki fałszywie dodatnie) [10, 13]. Błędne wyniki typowań wykonanych metodą serologiczną w porównaniu z typowaniem genetycznym sięgają od 20 do 30% [8, 9]. Uzasadnione jest więc stosowanie jako referencyjnych metod genetycznych do oznaczania HLA-B27.

Metody genetyczne

Metody molekularne mimo ich wyższej wiarygodności wchodzą do rutynowej diagnostyki z pewnymi oporami ze względów ekonomicznych i z powodu ograniczonej liczby pracowni biologii molekularnej. W badaniach tych stosowana jest reakcja łańcuchowa polimerazy (polymerase chain reaction – PCR), w której namnaża się przy użyciu swoistych starterów fragmenty DNA poszczególnych genów układu HLA. W tab. 1 znajduje się wykaz technik molekularnych dostępnych w analizie HLA. W pierwszej grupie metod w jednej reakcji PCR powielane są fragmenty DNA kodujące badane locus HLA pacjenta, a detekcja poszczególnych alleli w danym locus odbywa się z wykorzystaniem: SSO, RFLP, SBT, FP, SSCP, RSCA lub technologii mikromacierzy (tab. 1).

Tab. 1. Zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w badaniu HLA [7 – zmodyfikowane]

Obecnie najczęściej stosowane są metody PCR-SSP i SSO, dla których odsetek błędów nie przekracza 3% [14]. Bezpośrednie sekwencjonowanie ze względu na bardzo wysoki koszt jest wykonywane tylko przy konieczności uzyskania wyników o wysokim stopniu rozdzielczości, tj. określających poszczególne allele występujące u badanej osoby. Ponadto jest niezastąpione przy poznawaniu nowych alleli HLA. Na szczególną uwagę zasługuje system mikromacierzy do oznaczania HLA-B27 w diagnostyce ZZSK. Test microarray HLA-B27 został zaprojektowany i zoptymalizowany tak, by w reakcji PCR amplifikowały się wszystkie obecnie znane podtypy HLA-B27 (51 alleli). Detekcja alleli odbywa się poprzez hybrydyzację znakowanych fluorescencyjnie produktów reakcji PCR do allelospecyficznych sond na mikromacierzy, czemu towarzyszy emisja fluorescencji [15].

Tab. 2. Wykaz alleli HLA-B27 wykrywanych za pomocą systemu microarray HLA-B27 [15]

Tab. 3. Interpretacja wyniku HLA-B27 uzyskanego w teście microarray HLA-B27 [15]

*Analiza sekwencyjna egzonu 2 genu HLA-B w celu różnicowania niezwiązanych z ZZSK podtypów HLA-B*2706 i HLA-B*2709.

V. Podsumowanie

HLA-B27 stanowi czuły marker genetyczny zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa. Ryzyko rozwoju objawów choroby u osób obciążonych genetycznie wynosi ponad 90%. Wiele danych literaturowych świadczy o tym, że czynniki genetyczne mają decydujące znaczenie dla wystąpienia ciężkiej postaci ZZSK. Takie parametry, jak: wiek, w którym pojawiły się pierwsze objawy, zmiany radiologiczne, a także aktywność choroby mierzona w BASDAI (Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index) i BASFI (Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index), są dziedziczone odpowiednio w 40%, 62%, 51% i 76% przypadków [16–20]. Przedstawione dane dowodzą, że HLA-B27 jest przydatny w przewidywaniu ryzyka wystąpienia ZZSK, rozpoznaniu wczesnego stadium choroby, może również zwiastować jej ciężki przebieg. Wiedza na temat roli czynników genetycznych w rozwoju ZZSK jest wciąż niepełna i wymaga ogólnoświatowych badań populacyjnych, które przyczynią się do zrozumienia patofizjologii tych schorzeń. Wymaga to oznaczenia specyficznych markerów genetycznych przy użyciu pewnej, wystandaryzowanej metody. Typowanie na poziomie DNA pozwala na wykonanie, w zależności od potrzeby, oznaczeń na różnym poziomie rozdzielczości. Jest metodą bardziej wiarygodną i lepiej wystandaryzowaną w porównaniu z testami serologicznymi podatnymi na błędy.

VI. Piśmiennictwo:

1. Gran J.T., Husby G. Epidemiology of ankylosing spondylitis. In: Rheumatology. Hochberg M.C., Silman A.J., Smolen J.S., Weinblatt M.E. (eds.) 3rd Ed. Mosby, London 2003; 102: 1153–1159.

2. van der Linden S., Valkenburg H.A., Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis. A proposal for modification of the New York criteria. Arthritis Rheum 1984; 27: 361–368.

3. Rzeszotarska A., Korsak J. Antygeny zgodności tkankowej i ich implikacje kliniczne. Mag WIM 2006; 2: 7–10.

4. Wiland P., Filipowicz-Sosnowska A., Głuszko P., Kucharz E.J., Maśliński W., Samborski W., Szechiński J., Tłustochowicz W., Brzosko M. Rekomendacje w postępowaniu diagnostycznym i terapeutycznym u chorych na zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa. Opracowane przez Zespół Konsultanta Krajowego z dziedziny Reumatologii. Reumatologia 2008; 46, 4: 191–197.

5. Mungall A. et al. The DNA sequence and analysis of human chromosome 6. Nature 2003; 425: 805–811.

6. Akkoc N., Khan M.A. Etiopathogenic role of HLA-B27 alleles in ankylosing spondylitis. APLAR Journal of Rheumatology 2005; 8: 146–153.

7. Konopka L. Aktualne zasady immunologicznego doboru komórek hemopoetycznych do przeszczepów. Postępy Nauk Medycznych 2000; 4: 51–56.

8. Bogunia-Kubik K., Lange A. Typowanie antygenów zgodności tkankowej u potencjalnych dawców i biorców przeszczepów komórek hemopoetycznych. Acta Haematologica Polonica 2000; 31: 113–125.

9. Nowak J., Mitka-Witkowska R., Siwik D., Zajko M., Łopacz P., Sak-Budzisz J. Porównanie wyników typowania HLA klasy I uzyskanych metodami serologicznymi i molekularnymi – analiza błędów. Acta Haematologica Polonica 2004; 35: 251–257.

10. IOTest® HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE. Instrukcja wykonania testu.2007.www.beckmancoulter.com

11. Przeciwciała monoklonalne HLA-B27 skoniugowane z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Instrukcja wykonania testu. 2004. www.onelambda.com

12. Neumüller J., Fischer M., Eberl R. Failure of the serological determination of HLA-B27 due to antygen masking in patients with ankylosing spondylitis. Rheumatol Int 1993; 13: 163–167.

13. Kirveskari J., Kellner H., Wuorela M., Soini H., Frankenberger B., Leirisalo-Repo M., Weiss E.H., Granfors K. False-negative serological HLA-B27 typing results may be due to altered antigenic epitopes and can be detected by polymerase chain reaction. British Journal of Rheumatology 1997; 36: 185–189.

14. Noreen H.J., Yu N., Hurley C.K., Ohashi M., Baisch J., Endres R., Fernández-Vińa M., Heine U., Hsu S., Kamoun M., Mitsuishi Y., Monos D., Perlee L., Rodriguez-Marino S., Smith A., Yang S.Y., Shipp K., Weis T., Howard A., Kollman C., Hegland J., Setterholm M. Validation of DNA-based HLA-A and HLA-B testing of volunteers for a bone marrow registry through paralel testing with serology. Tissue Antigens 2001; 57 (3): 221–229.

15. EUROArray HLA-B27. Test instruction for the molecular genetic test. 2008. EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG.

16. Brown M.A., Brophy S., Bradbury L. et al. Identification of major loci controlling clinical manifestations of ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum 2003; 48: 2234–2239.

17. Hamersma J., Cardon L.R., Bradbury L. et al. Is disease severity in ankylosing spondylitis genetically determined?. Arthritis Rheum 2001; 44: 1396–1400.

18. Brophy S., Hickey S., Menon A. et al. Concordance of disease severity among family members with ankylosing spondylitis?. J Rheumatol 2004; 31: 1775–1778.

19. Brown M.A. Breakthroughs in genetic studiem of ankylosing spondylitis. Rheumatology 2008; 47: 132–137.

20. Brown M.A. Progress in studies of the genetics of ankylosing spondylitis. Arthritis Research & Therapy 2009; 11: 254–259.

Przegląd Reuamtologiczny 2010, nr 3 (32), s. 6-7.